李戈，广东省人民医院医学研究部特聘副研究员，毕业于中山大学干细胞与组织工程专业，主要从事干细胞与组织工程联合修复组织损伤的研究。共主持基金2项，参与8项。近五年内发表论文9篇，其中以第一作者或共一作者身份发表SCI论文4篇（最高影响因子10.317，中科院分区1区），授权专利3项，参编专著1本。中国研究型医院学会神经再生与修复专业委员会委员。

 

1. 引言

相比于周围神经再生，中枢神经损伤后的再生涉及一系列更为复杂的微环境与细胞内信号调控机制。如何优化受损伤组织微环境并提高神经移植物的结构仿生性，是利用组织工程原理修复中枢神经损伤的主要策略和急需攻克的难题。自体周围神经或去细胞周围神经移植物因其结构仿生性和较低的免疫原性被用于修复周围神经，并取得了良好的疗效。中枢神经移植物在理论上也具有很好的结构仿生性，但因其具有强烈的抑制神经再生微环境而较少被作为修复神经损伤的天然生物材料。因此，优化中枢神经组织微环境可以为组织工程神经移植物修复中枢神经损伤提供新思路。

2. 结果展示

1）脱细胞视神经、脱细胞坐骨神经、脱细胞脊髓的特征。同种异体移植物中的核残留物可能在宿主体内引起一系列免疫反应，导致严重的副作用和组织修复受损。因此，在评估脱细胞效果时，最重要的任务是量化去细胞材料中的核残留物。我们建立了三个关键标准：（1）经H&E或4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色后，组织切片上无可见核残留物；（2）dsDNA含量<50 ng/mg（冻干重量）；（3）琼脂糖凝胶电泳DNA片段<200 bp。组织块的显微镜检查显示正常组织（NT）的无空隙结构和脱细胞组织（DT）的多孔结构（图1A和B）。我们还观察到去细胞后组织切片中没有核染色（图1B）。在所有DTs中，DNA含量均小于50 ng/mg（冻干重；视神经（ON）: 150.79 ± 13.98 ng/mg; 脱细胞视神经（DON）: 17.60 ± 2.73 ng/mg; 坐骨神经（SN）: 205 ± 79.97 ng/mg; 脱细胞坐骨神经（DSN）: 7.57 ± 0.09 ng/mg; 脊髓（SC）: 359.30 ± 78.19 ng/mg; 脱细胞脊髓（DSC）: 9.3 ± 7.35 ng/mg; n = 3, P < 0.01; Fig. 1C).在任何DTs的凝胶电泳期间未观察到DNA信号（图1D；n=3）。综上所述，这些结果证实细胞成分被有效地从DTs中去除。

2）ON的去细胞化促进了神经突起的生长。为了评估DTs对神经突起生长的影响，我们在纵向组织切片上进行了体外被根神经节（DRG）实验。DRG生长72小时后，细胞和组织固定，神经突起用抗神经丝-200抗体（神经标记物NF）免疫荧光标记。然后在荧光显微镜下测定神经突起的最大延伸距离和分支数（图2A和B）。图2C中的示意图显示了如何定义最大延伸距离和分支数量。结果显示，在DON和DSC上生长的神经突起明显延长（714.62±148.02和515.98±206.57μm，n=5/组），分别为83.00±110.02和0.00±0.00 μm/组。与ON（8.25±10.90）和SC（0.00±0.00）相比，DON组（41.75±19.64）和DSC（62.75±13.94）组的轴突分支数目（n=5个/组）也显著高于ON组（8.25±10.90）和SC（0.00±0.00）。然而，神经突起的生长在SN和DSN上表现出相似的活力（长度分别为560.13±190.60 μm和387.61±13.81 μm；分支分别为36.60±17.39和22.67±7.23；每组n=5；图2B）。这些结果表明，去细胞能促进DRG神经突起在中枢神经组织上的生长，包括ON和SC。尽管切片上的天然基质不利于轴突生长，但有些轴突（图2D中的白色箭头）仍然能够在神经纤维束区域之间（图2D中的白色星号）沿着结缔组织间隔生长（图2D中的白色箭头）。这表明，与神经纤维束区相比，结缔组织间隔可能含有一些支持轴突延伸的成分，或者缺少一些抑制轴突生长的成分。

 

 

3）DON对神经突起定位和神经元附着的影响。沿着DON结缔组织间隔生长的神经突起暗示着组织内存在一些定向特征（图2D）。为了进一步验证DON在引导轴突延伸方向中的作用，我们在DTs（DON、DSN和DSC）和NTs（ON、SN和SC）上植入分离的DRG神经元。培养72小时后，我们观察到，与NT切片（图3A1-3，箭头）相比，更多的DRG神经元附着在DT切片上（图3A1-3，箭头）。值得注意的是，在三个DT切片中，生长在DON上的NF阳性神经突起显示出最一致的定向（图3A1'-3'）。我们通过测量NF阳性神经突起和组织切片纵轴之间的角度来量化这种现象（图3B）。角为0°–30°的神经突起的比例，分别计算了DON、DSN和DSC组的30°-60°和60°-90°。在DON切片（76.90%；图3C）上，与DSN（64.70%）和DSC（38.90%）相比，偏差角为0°-30°的神经突起比例更大。这表明DON对轴突生长有较强的定向作用。此外，我们通过计算神经元密度（NF和Hoe在0.5 mm×0.5 mm区域内双重标记的神经元数量）来评估不同组织切片上的细胞粘附性（图3D）。神经元密度在DON（18.13 ± 9.05/0.25mm²）和DSC（12.25 ± 4.50/0.25mm²）组明显高于ON（10.80 ± 6.02/0.25mm²）和SC（2.50 ± 3.00/0.25mm²）组（图3E）。然而，在DSN组（5.00 ± 2.92/0.25mm²）和SN组（8.00 ± 1.00/0.25mm²）之间，NF阳性细胞的数量没有显著差异（图3E）。

 4）ON脱细胞主要保存轴突阳性蛋白。DT 和NT之间神经生长的不同可能与去细胞过程中成分的变化有一定的关系。因此，我们对所有三个DTs进行了蛋白质组学分析，并比较了DON、MON和EON组中每个组的三个重复序列中检测到的蛋白质组分的变化。我们从DON、DSN和DSC组筛选ECM蛋白，并使用Venn图（图4A和补充图1）可视化它们的集合关系。如补充图1所示，大多数胶原家族蛋白都存在于DON和DSN中，而其他蛋白质如层粘连蛋白β1和TGFβ1都存在于DON和DSC中。去细胞化后，丢失了1161个蛋白质（图4B；蛋白质数量从2336个减少到1175个）；其中只有9个ECM蛋白质丢失（图4B；ECM蛋白质的数量从53个减少到44个）。这表明细胞外基质蛋白在去细胞过程中被选择性保留，而细胞内的蛋白质如β-肌动蛋白被去除（补充图2）。通过对两种普遍存在的ECM成分（COL4和LAM；每批n=3；三个完全去细胞批次）的斑点杂交检测进一步证实了这些结果；与MON相比，DON和EON的浓度增加（图4C）。如图4D所示，在去细胞后观察到不同ECM蛋白的上调和下调。在标记每个ECM蛋白与轴突生长相关的生物学功能后，我们发现大多数（八分之七）与轴突延伸相关的促生长蛋白[例如COL4和层粘连蛋白B1（LAMB1）]在去细胞后得到保存和富集。相反，大多数（七分之五的）抑制轴突延伸蛋白[例如，髓鞘相关糖蛋白（MAG）、维生康（VCAN）、双聚糖（BGN）和去核蛋白（DCN）]在去细胞后检测到较低水平（图4E）。

 

       5）DON中的COL4和LAM保持生物活性以支持轴突生长。为了验证去细胞后保留的基质蛋白的功能活性，我们选择COL4和LAM作为试验蛋白，因为它们在促进神经再生方面具有已知的活性。图5A显示了对照组DON切片上DRG轴突生长的状态；不同半径的红色虚线表示用于确定交叉点的定量方法（图5C）。我们使用抗COL4（thermofisher，PA1-28534）或LAM（Abcam，ab11575）的抗体来阻断DON中这些蛋白质的功能。随着抗体浓度的增加，DON神经突起的长度和密度均呈下降趋势。此外，将COL4或LAM重新引入培养环境可恢复DON中DRGs的轴突生长活性（图5B–D；n=每组5个）。这些结果表明，保留在DON中的COL4和LAM对神经突起的生长起到了支持作用。考虑到与COL4相比，LAM的抑制或再引入会导致神经突起长度和密度发生更显著的变化，因此可以合理地假设LAM比COL4更能支持神经突起的生长。同时，在DON中加入三种浓度梯度的髓磷脂，以评价髓磷脂对DON的抑制作用。加入高浓度（8μg/μl）或中等浓度（0.8μg/μl）的髓磷脂后，轴突生长明显减少（P<0.05）。然而，低浓度组（0.08μg/μl）和对照组之间没有观察到显著差异（补充图3）。这些结果表明了髓磷脂的抑制作用和COL4/LAM的促生长作用。下一节讨论COL4/LAM的下游配体-受体途径。

 

      6）保留在DON中的COL4和LAM可以与ITGA1结合。由于去细胞化包括物理震荡、化学溶解和酶分解，这些都可能破坏蛋白质结构，所以目前尚不清楚DON中保留的ECM蛋白是否能通过与它们的蛋白伙伴结合而发挥作用。整合素在神经元细胞膜上的分布和活化在轴突再生中起着重要作用，而COL4/LAM与ITGA1的相互作用可以促进交感神经细胞轴突的生长。免疫组化显示，COL4和LAM在DON中清晰表达（图6A）。在植入DRG三天后，我们观察到在DON切片中ITGA1沿着突起的点状表达（图6B）。使用小干扰RNA（siRNA）抑制生长在COL4底物上的DRG神经元中ITGA1的表达，与对照组中正常延伸的轴突相比（补充图4；补充视频剪辑2），导致了轴突的退出（补充图4；补充视频剪辑2）。这些结果证实了ITGA1在调节DRG轴突生长中的重要作用。随后，在我们的DON–DRG培养系统中，使用以ITGA1为诱饵的共IP技术研究了ITGA1与其ECM伙伴（COL4和LAM）的相互作用（图6C；n=3个重复）。我们的结果表明COL4和LAM都与ITGA1相互作用，如图6D所示。

3.研究思路

 

4. 总结

    脱细胞改变中枢神经组织微环境示意图。脱细胞处理对于中枢神经来源的组织细胞外基质蛋白改变表现在抑制神经生长的髓鞘成分和硫酸软骨素成份减少，同时保留不可溶的胶原家族和层粘蛋白家族，从而在去细胞视神经中表现出支持或促进神经突起生长的蛋白成份比例增多，使整体微环境由稳态转变为促进态。

     

 

原文链接：  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961220305354?via%3Dihub（Biomaterials，IF= 10.317）

 

特别鸣谢：

 

本文转自：GD省医公共实验室公众号

 

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