秦玮，博士毕业于香港科技大学化学专业。现入职广东省人民医院医学研究部，主要研究方向为有机发光功能材料的合成及其生物荧光成像的应用。发表SCI论文50余篇，其中以第一作者/通讯身份发表SCI学术论文16篇，包括Adv. Mater., Adv. Funct. Mater., Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Eng. J., Chem. Mater., 和Chem. Sci.等国际著名材料学和化学期刊。以项目主持人身份获得国家自然科学基金面上项目和中央高校基本科研业务费专项资金的资助。

1. 引言

利用可视化荧光信号监控大脑的状态是研究常见脑部疾病的重要方法。双光子荧光（2PF）显微成像因其激发光在传统的近红外区（NIR-I，700-1000 nm），广泛应用于活体生物组织的成像。总的来说，即使借助于脑部的颅窗，因激发光束在生物组织中的信号衰减，2PF显微成像通常局限于脑部浅层组织。与传统的2PF显微成像方式不同，三光子荧光（3PF）显微成像利用近红外二区波段（NIR-II，1000-1700 nm）更长的激发光和更高阶的非线性光学效应，显著的提高了穿透深度、时间、空间分辨和信号背景比。然而，3PF显微成像的一个主要问题是缺少具有大的三光子吸收截面和高的荧光量子产率的有机染料。

聚集诱导发光（AIE）的有机荧光材料因其良好的生物相容性和光稳定性等特性，近年来已有不少AIE发光材料被开发出来并用于生物成像的研究。但是，大多数的材料是基于四苯乙烯（TPE）的分子骨架，拥有相对复杂的分子结构，增加了AIE分子设计和合成的难度。因此，设计分子结构简单、合成简易的具有显著3PF性质的高效AIE荧光染料，仍旧是一个亟待解决的难题。

为了解决上述问题，研究者设计和合成了新的AIE荧光分子BTF。该分子结构中含有电子给体三苯胺（TPA）、电子受体富马腈（FN）和叔丁基（t-Bu）基团。这种典型的电子给体-受体（D-A）结构，使分子具有深红/近红外（FR/NIR）发射和显著的多光子吸收的能力。该分子化学结构简单、合成简便，具有显著的AIE特征和高效的固态荧光量子产率（42.6%）。它能够通过简单的纳米沉淀的方法，制备成尺寸均匀的AIE点。该AIE点拥有高的发光效率、优良的生物相容性、大的Stokes位移、良好的光稳定性和大的三光子吸收截面。该AIE点可用作有效的3PF纳米探针，对活体小鼠血管进行3PF显微成像。这是首次报道利用AIE点作为3PF纳米探针，对完整颅骨小鼠的脑血栓过程进行高分辨活体生物成像。这项工作将会有助于研发新的高效非线性发光材料，用于非侵入性活体生物显微成像和常见脑部疾病的研究。 

2. 结果展示 

    1）研究者设计和合成了有机荧光材料BTF，它的分子结构中含有叔丁基（t-Bu），电子给体三苯胺（TPA）和电子受体富马腈（FN）。这种分子具有典型的强的电子给体-强的电子受体结构，使分子具有FR/NIR发射和显著的多光子吸收的能力。BTF在它的纯四氢呋喃（THF）溶液中发出微弱的荧光。在它的THF溶液中加入少量水时（f_w≤ 50%），因为典型的扭曲分子内电荷转移（TICT）效应，使BTF的发光红移，强度减弱。随着水含量的进一步增加（f_w≥ 60%），BTF分子由于疏水作用而形成纳米聚集体，缓解了TICT效应，使AIE效应成为主导因素，导致BTF溶液的荧光强度增加。当溶液中水含量f_w = 90%时，光谱强度达到最大值，是纯THF溶液发光强度的5倍。因此，BTF具有典型AIE分子的特征。

 

    2）通过晶体结构分析进一步发现，BTF分子呈现非平面的分子构型。其晶体中存在强烈的C-H⋯N氢键（键长< 3.3 Å）和C-H⋯π 相互作用。这种相邻分子之间的相互作用极大地限制了分子的运动，有效地抑制了激子的非辐射性衰变，使得分子能够在晶体状态下发出强烈的FR/NIR发光。

    3）为了提高BTF分子的水溶性，利用双亲性聚合物F-127包裹制备成BTF点，其聚集态量子产率为36.1%。BTF点在1550 nm飞秒（fs）激光激发下能够激发出3PF（峰位650 nm）和三次谐波信号（峰位517 nm）。值得注意的是，3PF信号比三次谐波信号更强，波长更长，更有利于体内深层组织成像。通过测试，BTF的三光子吸收截面为2.56×10^-79cm⁶s²。用1550 nm的fs激光连续照射40分钟, BTF点在磷酸盐缓冲液和水中的3PF强度保持在初始强度的90%以上，这种良好的光稳定性有利于长时间的生物成像的应用。因为BTF点的良好的生物相容性特性，利用BTF点作为3PF探针，观察小鼠在开颅情况下的脑血管，得到了在不同穿透深度下产生的三次谐波信号和3PF信号，实现不同模式下的荧光成像，增加了生物成像的可信度。同时获得了小鼠脑血管三维高分辨率重构图。

 

    4）基于3PF显微成像技术和BTF点本身的优势，实现了穿颅条件下小鼠脑血管成像，得到了高分辨3PF显微成像图。通过该图像，能够清晰的观测到小鼠脑部主要血管和微小毛细血管的空间网络结构。同时，标记了不同深度下毛细血管的半高宽分别为0.95，1.59和2.08 μm。脑血栓是一种常见的脑部疾病，可导致急性脑损伤甚至死亡。因此，研究者进一步利用BTF纳米点探针进行3PF显微成像，用于监测完整颅骨小鼠的脑卒中过程。在大视场中可以清晰的观查到血栓形成前后脑血管内3PF信号的强烈变化。

3. 研究思路和总结

研究者合成了高亮的AIE固体发光材料BTF（量子效率 = 42.6%）。通过纳米沉淀的方法制备的相应AIE点具有高亮度、大Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光稳定性和大的三光子吸收截面。它们可以用作高效荧光纳米探针，用于高穿透深度和高对比度的近红外激发的活体3PF脑血管显微成像。这是首次报道利用AIE点作为3PF纳米探针对完整颅骨下脑血栓过程进行高分辨活体生物成像。这项工作将会有助于研发新的高效非线性发光染料，用于无创监测大脑疾病或功能紊乱的研究。

 

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202000364 (Advanced Materials, IF=27.398)

 

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本文转自：GD省医公共实验室公众号

 

 

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